邢唷��>� 46���3������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������欹�] ��bjbj簞簞 * 仡!b仡!b�N�������€€���������8H$l|b��(�������������$���!�!������!�����6���������������������郹XT烘�����
^��L0|�"k~"�"��\��������!!�����|������������������������������������������������������������������������"���������€B�: Yeast DNA isolation
This produces very high quality DNA for southern blots. For PCR templates use the extended yeast colony PCR protocol instead.
Harvest 2ml stationary phase yeast culture in a 2ml tube
Spin 1 min at 2,500g, re-suspend pellet in 1ml 50mM EDTA
Spin 1 min at 2,500g, re-suspend pellet in 250祃 Buffer A (with DTT and lyticase) by gentle pipetting, incubate at 37( for 45 minutes
Spin 5min at 1,000g, re-suspend pellet in 400(l buffer B (including RNase A) by gentle pipetting, incubate 30 min at 37(
After this point, handle sample only with cut tips. Do not vortex at any point.
Add 4(l 20mg/ml Proteinase K, mix by inverting gently 6-8 times, incubate 30 min at 65(
Add 160(l 5M KOAc, invert to mix and incubate 30 minutes on ice
Spin 10min at 10,000g at RT, pour the supernatant into a 1.5ml tube
Add 500(l pH8 phenol/chloroform, mix on wheel for 30min, spin 10 min at 10,000g, extract with a cut blue tip
Add 0.4ml isopropanol, invert to mix
Spin 10 min 10,000g at RT, wash pellet with 70% ethanol, dry 10 min at RT
Add 20祃 TE incubate overnight at 4(
Next morning flick gently to mix (be gentle with this!)
Handle samples with cut tips to maintain DNA integrity, store at 4(.
It is almost impossible to accurately pipette or quantify the genomic DNA as it too gloopy, and the solution is never heterogeneous. Instead, for a southern digest 10祃 DNA per lane, then ethanol precipitate, then quantify.
Buffer A: 1.2M sorbitol
50mM EDTA
10mM DTT (added fresh from 1M stock)
340U/ml lyticase (added fresh)
Buffer B: 0.3% SDS
50mM EDTA
100(g/ml RNase A (added fresh from 20mg/ml stock)
TE: 10mM Tris pH8.0
1mM EDTA
RNase A: 20mg/ml in H2O
Heat for 15min at 95( to inactivate residual DNase
Store at -20(
Lyticase: 8.5U/祃 lyticase
10mM Na Phosphate pH7.0
50% glycerol
Weigh out a few mg solid lyticase (Sigma L4025, our low grade material not the super high quality stuff used for PFGE), calculate the required amount of buffer (the activity per mg should be written on the side of the pot) and dissolve by pipetting. This solution is not very stable (it will last a maybe a year at -20(), so don抰 make too much at once.
Store both powder and solution at -20(.
FILENAME Yeast DNA Isolation v3.6 Houseley lab
PAGE 1
,N������������� ! ) 0 5 Y f m o { } ~ � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � � 雉觑廪谥纤撬炙炙炕烦非没稽脺访怀烦烦没晳幻幻猾�hi$� jm�h篈�h蛅y j梆h篈�hiphNV"h'C�hv�hJAAh�>hs&�h琌_h襴�hRO�hRO�hRO�hGqhkc h�Zh�ZhNV"6� h�Z6� h﨨�6�h�Zh�Z6�h篈�9���� � �
Y
Z
�
�
�
�
9:�����������������������������勑�0齘勑`�0齡d琌_勑�0齘勑`�0齡d�>gd襴�� � � �
X
Y
Z
_
`
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
:@ABDHOYn{������������
%&豇豇黹遴亻馒榛卖肤馒糸馒豇超豇豇袈轼狋辐舴簸肤�h$ZRhkc h�� jm�hJAAh﨨�h鮔� jm�h篈�hJAAh蛅y j梆h琌_ jm�h琌_hNV"hNV"6� hNV"6�hNV"h篈� j梆h篈�h�>h琌_hi$�=>?wx���
�
�
�
�
�
�
$0ef{����������������������������������gd琌_gd﨨�&<=L\_vx����D
e
{
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
67Xeiz{�������������>J�T`gh������顸黹掊轫轫隈顸顸窒酥岂狂诟谒陧粟粟岗岗杯�h�4'h靦 hw)�h﨨�h廳Z j梆h廳Z j梆h﨨� h﨨�H*hBM� jm�h琌_h琌_h廳Z j梆h�Zh�Zh$ZRh鮔�h﨨� j梆h靦 h靦 A)����������������������������������$a$gd鵘.劆^劆gd廳Z�����������������������黧黧黧黧腌朕脍昼溢嚷鹊╃螈h�4'h靦 jh琌_0JU�*h'C�0JmHnHu�*
h琌_0Jjh琌_0JUh[@�hGqhkc h'C�mHnHuh琌_jh琌_Uh�:�jh�:�U(靶/ 班=!�"�#悹$悹%�芭芭惻
s2���� 0@P`p€�����2(�� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€����� 0@P`p€�8X�V~�����€�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@�� 0@ OJPJQJ_HmH nH sH tH D`�DNormalCJOJQJ_HmH sH tH 44 Heading 1$@&DA`��DDefault Paragraph FontVi��VTable Normal :V�4�4�
la�(k ��(No List4>@�4Title$a$5丆J(4@4u�Header
�9r 4 @4u�Footer
�9r .)@�!.u�Page NumberH�2H�+@Balloon TextCJOJQJ^JaJPK!檗�[Content_Types].xml瑧薔�0E鱄鼉�-J湶@%閭菐洽|廊�$韶钵UL襎B� l,�3鳛;鉹�得槣B+$�G]ミ7O侪V墎�c:菜�E3v@釶莮�憇� |煓w�<�<爔k猴ll5�
玈Z埣2O,辜帣Q績� €‰壪�5y�;y=卐E颎翼帊|\P疼 鞭M7�$|n]�枌蓢]4忥`窾6涀G冼(垲�^斗菹颻琖��-翻関]m蓿瓄� 飍祡缧暺}攙旯缦r�鍧竔倲崜0�� D3劂梋閐�3譙钐嚟�耳杧:忲�8}d-楀鉯*壵x上轻qCよZ}�柣WlшqyI@赹剟6橧!Q_� ﹪s殔刏賩a汛癶H魉Tm�jyV`垆纅�榾惫�<箣犇鼁YpL8�*аx侏S&机;EUC�8⒊eE�<В悟hg贇!燴H睩x0�
VM螽憆刳u�6拺覦s�3
U慮赢b��6�怂5y嵳2臓iz嘜]r汯璠�'鋆炃弦u涎4jj採�K臀F娃盶�晕�$4寨-莓�-�珠`餜�熘��&藑代觥瀈A<吼"xNW﹦� �
袬鞩R賭[鋺萵
8r� i箯K~�*~P(5黕莲z胦Wm忒杮~乖鞹濦caT鲇�.}x
E僮5抉&Z緄�2bQ懇/,EE\}�)W�乹埼鉠ミ�6;礏弛�糿h礜贻~7�威�9R`痌
糧疩〞儬嗾J拁▄旿郢�=$燮朗Sb酻紇���PK!
褠煻'theme/theme/_rels/themeManager.xml.rels剰M
�0匃倃oo雍�&輬协�勪5
6?$Q祉
�,.嘺緳i粭澤c2�1h�:闀q毩m胳嶡RN壻;d癭値o7�g慘(M&$R(.1榬'J摐袏T鶂�8V�"&A然蠬鱱}狇�|�$絙{�朠�除8塯/]As賲(⑵锑#洩L蔥汉倪��PK-!檗�[Content_Types].xmlPK-!ブх�60_rels/.relsPK-!ky���theme/theme/themeManager.xmlPK-!稝��theme/theme/theme1.xmlPK-!
褠煻'� theme/theme/_rels/themeManager.xml.relsPK]�
���� @@MMMP� &�
+AHJP�晙!�晙�8�@����€€€�饞��0�( �
�養
�S���� ?�PXdm����BJ��������� o~����������� 33������Ym������X��ln����������
%%\v����VX��J�T`��������� ������Ym������X��ln����������
%%\v����VX��J�T`��������������� Q�Pk靦 ~CGqip�>id�kc )!NV"癮$ao$�4'鵘.隠5秜=�+@雚@JAAzO$ZR�T0VdgX�Z廳Z�0[�>\^琌_T,dPxe�i�2u蛅y��8�﨨���O��������s&��:���v�v�f{���W �.�\��'�S'�Q>��j��!�RO�i$�BM���.J��i���[@�u�2�鍰�鮔�w)�篈�嘜�'C�p�襴����@€ffff �@��Unknown������������G��*郃x� �Times New Roman5�€Symbol3.��*郈x� �Arial3��*郃x� �Times5.��.醄`�)�TahomaA���$B�Cambria Math"1��hτ{f駼eG養eG4�LiLi!����€4��€2僸��HP�?����������������������篈�2!xx�k臱
���Yeast DNA isolationDavid Tollervey
Michelle King�鄥燆鵒h珣+'迟0��������
8DP
\hpx€�Yeast DNA isolationDavid TollerveyNormalMichelle King52Microsoft Office Word@鷂闎@�6烘�@豌*疵@|絆烘�Li�胀諟.摋+,0hp��������
���University of Edinburgh�Yeast DNA isolationTitle
��� !"���$%&'()*���,-./012������5���������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������Root Entry�������� �F皯fT烘�7€1Table��������"WordDocument��������* SummaryInformation(����#DocumentSummaryInformation8������������+CompObj������������r����������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������������
���� �F Microsoft Word 97-2003 Document
MSWordDocWord.Document.8�9瞦